PERCOBAAN 3
ANALISA
PIGMEN TUMBUHAN DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI KERTAS DAN SPEKTROSKOPI UV-VIS
A.
TUJUAN
PERCOBAAN
· Memisahkan zat warna dari ekstrak tumbuhan menggunakan
kromatografi kertas.
· Menentukan panjang gelombang maksimum yang diserap tiap
zat warna yang diperoleh.
· Menyarankan jenis dan struktur molekul klorofil dari data
spektrum UV-Vis yang diberikan instrumentasi spektroskopi UV-Vis.
B. PRINSIP PERCOBAAN
Memisahkan zat warna dari ekstrak tumbuhan menggunakan
kromatografi kertas berdasarkan gaya kapilaritas sehingga diperoleh
kromatogram. Kemudian kromatogram yang diperoleh dipisahkan dan dilarutkan
dengan pelarut etanol untuk di uji jenis dan struktur molekul klorofil dengan
menggunakan spektroskofi UV-Vis berdasarkan penyerapan energi radiasi elektromagnetik dari
sinar UV-Vis dengan energi tertentu,
sehingga elektron-elektron dalam larutan
sampel mengalami transisi elektronik dan kemudian elektron
tersebut kembali ke keadaan dasar dengan panjang gelombang tertentu
C. DASAR TEORI
1.
Kromatografi
Kromatografi
adalah suatu teknik pemisahan
molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase
gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada
larutan.
Molekul yang terlarut dalam
fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
Molekul yang memiliki ikatan yang kuat
dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah.
Dengan ini, berbagai
macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.
Komponen
utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi
menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme
pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel 1.1.
Tabel 1.1
Klasifikasi kromatografi
|
Kriteria
|
Nama
|
|
Fasa mobil
|
Kromatografi cair, kromatografi gas
Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi
|
|
Mekanisme
|
Kromatografi
pertukaran ion
kromatografi gel
|
|
Fasa stationer
|
Kromatografi kolom,
kromatografi lapis tipis,
kromatografi kertas
|
2.
Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas merupakan salah satu metode
pemisahan berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam
dan fasa gerak. Pemisahan sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan
dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana
lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom.
Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari
kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa
diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air
yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut
organik yang telah dijenuhkan dengan air.
Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat
padat berupa bubuk selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O
yang teradsorpsi dalam selulosa kertas. Fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa
untuk bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan
kromatografi kertas dilakukan dengan cara membandingkan harga relative response
factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention (tR) atau volume retention
(VR).
Nilai Rf
dapat ditentukan dengan cara:
Rf = jarak
yang ditempuh noda
jarak
yang ditempuh pelarut
Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran,
karena harga besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis
pengembang yang sama. Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan
hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai
cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga
arah pemisahan juga berubah.
Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan
larutan yang berisi sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1cm dari tepi
kertas. Setelah penetesan larutan pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan
dalam larutan pengambang (developing solution). Larutan ini
umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah dijenuhkan
dengan air.
Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari
gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat
diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan,
sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya
telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini.
Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya
sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi
kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis
ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar
kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil
(pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat
ini dapat digunakan (Shofyan, 2010).
Gambar 1.1 Contoh hasil kromatografi kertas
3.
Spektroskopi UV-Vis
Spektroskopi
UV-Vis adalah salah satu teknik analisis spektroskopik yang menggunakan radiasi
elektromagnetik UV dekat (190-380 nm) dan sinar tampak 380-780 nm dengan
menggunakan instrumen spektrofotometer. Dari spektrum absorpsi dapat diketahui
panjang gelombang dengan absorbans maksimum dari suatu unsur atau senyawa. Pada
prinsipnya spektroskopi UV-Vis menggunakan cahaya sebagai tenaga yang
mempengaruhi substansi senyawa kimia sehingga menimbulkan cahaya.
Panjang
gelombang lazim disajikan dalam satuan nm di mana 1 m = 10-9 nm.
Pada table berikut ini ditampilkan klasifikasi sinar tampak beserta warna
komplementernya (bila dicampurkan jadi tidak berwarna).
Table
1.2 Klasifikasi
sinar tampak dengan warna komplementernya
|
Panjang
gelombang (nm)
|
Warna
|
Warna
komplementer
|
|
400-435
|
Violet/ungu/lembayung
|
Hijau
kekuningan
|
|
435-480
|
Biru
|
Kuning
|
|
480-490
|
Biru
kehijauan
|
Jingga
|
|
490-500
|
Hijau
kebiruan
|
Merah
|
|
500-560
|
Hijau
|
Ungu
kebiruan
|
|
560-580
|
Hijau
kekuningan
|
Ungu
|
|
580-610
|
Jingga
|
Biru
kehijauan
|
|
610-680
|
Merah
|
Hijau
kebiruan
|
|
680-800
|
Ungu
kemerah-merahan
|
Hijau
|
(Sitorus,
2009).
Ada
dua aspek yang dapat di ukur dengan alat spektroskopi UV-Vis yaitu aspek kualitatif dan kuantitatif spektroskopi
UV-Vis:
1. Aspek
Kualitatif
Secara kualitatif,
spektroskopi UV-Vis dapat menentukan panjang gelombang maksimal, intensitas,
efek pH dan pelarut.
2. Aspek
Kuantitatif
Dalam aspek
kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan dan intensitas sinar
radiasi yang diteruskan diukur besarnya radiasi yang diserap oleh cuplikan
ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan
intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap
Jika suatu
molekul bergerak dari suatu tingkat energy tinggi ke tingkat energy rendah maka
beberapa energy akan dilepaskan. Energy ini dapat hilang sebagai radiasi yang
dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika satu molekul dikenai suatu
radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga molekul energi
tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa
penyerapan (absorbsi) energi oleh molekul. Supaya terjadi absorbsi, perbedaan
energi antara dua tingkat energi harus setara dengan energi foton yang diserap
(Sastrohamidjojo, 1991).
Ada tiga macam proses penyerapan energy
ultraviolet dan sinar tampak, yaitu:
a. Penyerapan
oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan
b. Penyerapan
oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks
c. Penyerapan
oleh perpindahan muatan
Pengukuran
absorbansi atau transmitansi dalam spektroskopi ultraviolet dan daerah sinar
tampak digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif spesies kimia.
Absorbansi ini berlangsung dalam dua tahap, pertama, yaitu transisi atau
eksitasi electron M+hv=M*. tahap kedua adalah relaksasi M* menjadi spesies baru
dengan reaksi fotokimia. Absorbsi dalam daerah ultraviolet dan daerah tampak
menyebabkan eksitasi electron ikatan. Puncak absorpsi (λmaks) dapat
dihubungkan dengan jenis-jenis ikatan yang ada dalam spesies. Spektroskopi
absorbsi berguna untuk mengkarakterisasi gugus fungsi dalam suatu molekul dan
untuk analisa kuantitatif. Spesies yang mengabsorbsi dapat melakukan transisi
yang meliputi:
·
Electron (e), pi (π), sigma (σ), non
bonding (n)
Jenis transisi ini terjadi pada
molekul-molekul organik dan sebagian kecil anion anorganik. Molekul tersebut
mengabsorpsi radiasi elektromagnetik karena adanya electron valensi, yang akan
tereksitasi ke tingkat energy yang lebih tinggi. Absorbsi terjadi dalam daerah
UV vakum (< 185 nm) sedangkan kromofor dengan energy eksitasi yang rendah
mempunyai daerah absorbsi di atas 180 nm. Electron dari molekul organic yang
mengabsorbsi meliputi electron yang digunakan pada ikatan antar atom-atom dan elektron
nonbonding atau elektron tidak berpasangan yang pada umumnya terlokalisasi.
Transisi elektronik pada tingkat-tingkat energy terjadi dengan mengabsorbsi
radiasi sehingga menyebabkan transisi σ------ σ*, n------ σ, n-----π, dan
π----- π*.
·
Absorbsi yang melibatkan
electron-elektron orbital d dan f
Unsur-unsur blok d mengabsorbsi
pada daerah UV dan daerah sinar tampak. Terjadinya transisi logam golongan f
disebabkan karena electron-elektron pada orbital f.
·
Transfer muatan electron
Komponen yang diabsorpsi harus
terdiri dari elektron donor dan elektron akseptor sehingga transfer elektron
dapat terjadi dan menghasilkan absorbsi radiasi (Krisnandi, 2002) .
Persyaratan
yang harus dipenuhi untuk absorbsi sinar tampak adalah larutan harus berwarna.
Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk cairan berwarna (Widyaningsih dan Faiqoh,
2009).
4.
Instrumentasi Spektroskopi UV-Vis
Bagian-bagian
dari alat spektroskopi UV-Vis adalah:
-
sumber cahaya
Sumber energy cahaya yang biasa
untuk daerah tampak dari spectrum itu maupun daerah ultraviolet dekat dan
inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat ranbut terbuat dari
wolfram. Pada kondisi operasi biasa, keluaran lampu wolfram ini memadai dari
sekitar 235 atau 350 nm ke sekitar 3 µm. energy yang dipancarkan olah kawat
yang dipanaskan itu beraneka ragam menurut panjang gelombangnya.
-
Monokromator
Ini adalah piranti optis
untuk memencilkan suatu berkas radiasi dari sumber berkesinambungan, berkas
mana mempunyai kemurnian spectral yang tinggi dengan panjang gelombang yang
diinginkan. Radiasi dari sumber difokuskan ke celah masuk, kemudian
disejajarkan oleh sebuah lensa atau cermin sehingga suatu berkas sejajar jatuh
ke unsure pendispersi, yang berupa prisma atau suatu kisi difraksi..
-
Kuvet
Merupakan wadah sampel. Kuvet yang baik untuk
spektroskopi UV-Vis yang terbuat dari kuarsa, yang dapat melewatkan radiasi
daerah ultraviolet ( < 350 nm). Kuvet
yang baik tegak lurus terhadap arah sinar untuk meminimalkan pengaruh
pantulan radiasi. kuvet harus memenuhi syarat-syarat diantaranya adalah tidak
berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya, permukaannya secara optis
harus benar-benar sejajar, harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan-bahan
kimia, tidak boleh rapuh dan mempunyai bentuk yang sederhana. Pada pengukuran
di daerah UV, dipakai kuvet kuarsa, sedangkan kuvet dari kaca tidak dapat
dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Sedangkan pengukuran di daerah sinar
tampak (visible), dapat digunakan semua jenis kuvet (Krisnandi, 2002).
-
Detector
Detector berfungsi untuk
menangkap sinar yang merupakan sinar terusan dari larutan sampel. Di dalam
amplifier sinar tersebut diubah menjadi signal listrik. Prinsipnya mengubah
energy foton diluar yang jatuh mengenai sampel dan mengubah energy tersebut
menjadi besaran yang dapat diukur (Anonim, 2011).
5.
Ekstraksi Pigmen
Ekstraksi
adalah proses pemisahan suatu bahan dari campurannya, biasanya
dengan menggunakan pelarut. Ekstraksi
dapat dilakukan dengan berbagai cara. Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan
pada kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam campuran. Pelarut polar akan melarutkan solut
yang polar dan pelarut non polar akan melarutkan solut yang non polar atau
disebut dengan “like dissolve like”. Tehnik ekstraksi lainnya misalnya
menggunakan air untuk mengambil pigmen alami dari tumbuhan, seperti: daun, dan lain-lain.
Ekstraksi pigmen adalah proses pemisahan pigmen dari
suatu bahan campurannya dalam jaringan tumbuhan menggunakan suatu pelarut
(Simon, 2008).
6.
Pigmen dalam Bayam
Bayam merupakan salah satu tanaman yang daunnya banyak
mengandung klorofil dan karotenoid. Klorofil merupakan zat
warna hijau pada daun. Klorofil adalah pigmen hijau yang ditemukan dalam banyak
tanaman. Klorofil berasal dari bahasa Yunani, yaitu chloros "hijau" dan phyllon
"daun". Klorofil a dan b adalah pigmen tumbuhan yang dibutuhkan dalam
reaksi fotosintesis, diproduksi di kloroplast pada jaringan fotosintesis yang
ada di daun. Klorofil a berwarna hijau biru
memiliki panjang gelombang maksimum pada 430 nm dan 669 nm, sedangkan klorofil b berwarna hijau kuning memiliki
panjang gelombang maksimum pada 453 nm dan 652 nm. Klorofil a menunjukkan Rf 0,4 dan klorofil b menunjukkan
Rf 0,38 (Wiwing, 2005)
Gambar 1.2. klorofil a dan klorofil b
Beta karotenoid adalah salah satu pigmen warna yang
terdapat di dalam daun bayam. Karotenoid biasanya menunjukkan warna kuning,
jingga dan merah jingga. Karena warnanya berkisar antar jingga sampai merah,
maka beta karotenoid mempunyai panjang gelombang maksimum berkisar 430-480 nm (Schwartz
dan Elbe, 1996) dan Rf 0,625.
Gambar 1.3. beta karotenoid
D.
METODOLOGI
PERCOBAAN
1)
Alat
dan Bahan
Alat yang digunakan adalah:
§ Mortal
§ Alu
§ Pisau
§ Beaker glass 600 ml
§ Chamber
§ Tabung reaksi
§ Pipet tetes
§ Gelas ukur
§ Botol vial
§ Pinset
§ Penggaris
§ Staples
§ kuvet
§ spektroskopi
UV-Vis cary 50
Bahan yang digunakan adalah:
§ kertas saring
§ air akuades
§ koin
§ pensil
§ etanol
§ aseton
§ daun bayam segar
§ uang logam
§
plastik wrap
2)
Skema
Kerja
1) Preparasi Sampel
· Di gunting berukuran 7 x 10 cm
|
Kertas saring berukuran 7 x 10 cm
|
·
Dibuat garis batas bawah 1,5 cm dari tepi bawah dan garis batas atas 1
cm dari tepi atas kertas
|
·
Dikeringkan dengan lap/kertas tissue
|
·
Ditempatkan pada garis pensil sehingga tertutup hingga lebar kertas
|
Daun bayam
di atas garis pensil
|
·
Ditempatkan penggaris di atas daun bayam mengikuti garis pensil
·
Ditekankan dan digoreskan sepanjang garis pensil dengan logam
·
Diulangi hingga garis hijau terlihat jelas
|
Warna hijau
daun menempel dan terbentuk pada kertas saring
|
2) Pemisahan
Pigmen
· Digulung
berbentuk silinder dengan cara distaples
· Diposisikan
garis/pita hijau diluar
|
Kertas
saring berbentuk silinder
|
·
Dimasukkan ke dalam beaker glass berisi 20 ml etanol
|
·
Diusahakan pelarut tidak menyentuh garis hijau
·
Ditutup beaker glass dengan plastic
wrap
·
Dibiarkan pelarut mengelusi sampel di kertas saring selama 5 menit
|
Kertas
saring di dalam beaker glass
|
Pelarut
bergerak naik dan pita-pita warna memisah
|
·
Dibuka tutup plastik beaker glass
|
Pelarut
hampir mencapai garis batas atas
|
·
Dikeluarkan kertas saring dari beaker glass
|
·
Dibiarkan mengering di ruangan gelap
|
3)
Ekstraksi Pigmen
·
Diluruskan dengan melepas staplesnya
|
·
Diukur jarak setiap pita warna dari garis batas bawah
·
Dihitung harga Rf setiap pita warna
·
Dicatat warna pita
|
Warna pita
dan Harga Rf setiap warna pita
|
·
Digunting setiap warna pita
·
Dipisahkan hati-hati
|
Potongan masing-masing
pita
|
·
Dimasukkan ke tabung reaksi yang berbeda
|
Tabung
reaksi berisi potongan pita
|
·
Diberi label dengan menuliskan harga Rf pita
·
Ditambah 5 ml etanol
|
Tabung
reaksi berisi potongan pita dan etanol
|
·
Ditutup dengan plastic wrap
·
Dibiarkan semua zat warna larut dalam etanol
|
Zat warna
larut dalam etanol
|
4)
Pengukuran Panjang Gelombang
·
Dimasukan blanko (etanol ) hingga 2/3 tinggi kuvet
·
Diambil kuvet blanko dan pegang bagian buramnya
·
Dibersihkan kaca transparan kuvet dengan tisu
·
Dimasukan dalam alat instrumentasi spektroskopi UV-Vis
|
·
Dibersihkan dari debu & pengotor lainya
|
Layar
computer menunjukan angka zero
|
kuvet
blanko dalam spektroskopi UV-VIS
|
·
Di pilih program “zero” pada layar komputer
|
·
Dikeluarkan kuvet dari alat instrumentasi
|
·
Di masukan kuvet sampel 1 dalam alat spektroskopi UV-VIS
|
Kuvet sampel dalam alat instrument
|
·
Di pilih program ‘START’ pada layar komputer
|
Kurva panjang gelombang sampel 1,
panjang gelombang dan absorbansi sampel 1
|
·
Di pilih “finish”
·
Di keluarkan kuvet sampel
·
Diganti dengan sampel berikutnya
·
Di pilih program ‘START’ pada layar komputer
·
Dilakukan proses pengoperasian
|
·
Di lakukan proses pengoperasian
|
Kurva panjang gelombang gelombang sampel
berikutnya, panjang gelombang dan absorbansi berikutnya
|
5) Analisa
Panjang Gelombang Maksimum Zat Warna
Panjang
gelombang maksimum tiap zat warna
|
·
Ditandai
·
Dicatat nilainya
|
Panjang
gelombang maksimum tiap zat warna
|
·
Dibandingkan dengan data literatur
·
Ditentukan klorofil a, klorofil b, karotenoid berdasarkan panjang
gelombang maksimum
|
Panjang
gelombang maksimum Klorofil a, klorofil b, karotenoid
|
E. HASIL PENGAMATAN
·
Pemisahan pigmen
|
No
|
Perlakuan
|
Pengamatan
|
|
1
|
Kertas saring kromatografi di gulung dengan posisi garis hijau bayam di
luar
+ dimasukkan
dalam beaker glass berisi 20 ml etanol
|
· Garis hijau bayam naik ke atas mengikuti elusi pelarut
· Terbentuk noda kuning (bawah), hijau (tengah), kuning
muda kehijauan (atas)
|
|
2
|
Di hitung Rf masing-masing noda
|
· Noda kuning = 0,4
· Noda hijau = 0,8
· Noda kuning muda kehijauan = 0,93
|
|
3
|
Masing-masing noda dipotong
|
|
·
Ekstraksi pigmen
|
No
|
Perlakuan
|
Pengamatan
|
|
1
|
Potongan noda Rf 0,4 dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 5 ml etanol
|
Warna noda pada potongan kertas memudar dan menghilang
|
|
2
|
Potongan noda Rf 0,8 dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 5 ml etanol
|
Warna noda pada potongan kertas memudar dan menghilang
|
|
3
|
Potongan noda Rf 0,93 dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 5 ml etanol
|
Warna noda pada potongan kertas memudar dan menghilang
|
·
Pengukuran panjang gelombang
|
No
|
Rf noda
|
Panjang gelombang
|
Absorbansi
|
|
1
|
Rf 0,4
|
276,0
220,0
208,1
|
0,326
1,411
1,400
|
|
2
|
Rf 0,8
|
665,0
416,0
208,1
|
0,100
0,143
1,169
|
|
3
|
Rf 0,93
|
207,0
|
0,828
|
F. PERHITUNGAN
Rf kuning muda kehijauan =
Rf hijau muda =
Rf kuning =
G. PEMBAHASAN
Sebelum melakukan kromatografi kertas, sebaiknya
dilakukan terlebih dahulu preparasi sampel dengan menyiapkan kertas saring,
chamber dan daun bayam. Dalam penyiapan kertas saring untuk kromatografi,
kertas saring harus dibuat garis atas dan garis bawah dengan ukuran 7 x 10 cm
untuk mempermudah menghitung jarak noda yang terelusi sehingga Rf noda dapat
dihitung dan komponen senyawa dari noda bayam dapat di analisis. Garis-garis
ini harus dibuat dengan menggunakan pensil, tidak boleh menggunakan pulpen/alat
tulis lain yang menggunakan tinta karena apabila menggunakan tinta maka tinta
dari alat tulis akan ikut terelusi pada saat kromatografi berlangsung sehingga
dapat mempengaruhi proses kromatografi. Sedangkan apabila menggunakan pensil,
karbon dari pensil tidak akan ikut terelusi karena karbon bersifat inert
sehingga tidak mempengaruhi proses kromatografi.
Kemudian daun bayam hijau harus dikeringkan terlebih
dahulu dengan lap/tissue untuk menghindari adanya kotoran yang kemungkinan
masih menempel pada daun yang nantinya dapat mengganggu proses elusi. Karena
kotoran-kotoran tersebut mungkin dapat membentuk noda tersendiri pada kertas
kromatografi. Untuk menempatkan noda daun bayam hijau pada kertas saring, cukup
dengan meletakkan daun bayam tersebut di atas garis batas bawah kemudian
digoreskan dengan menggunakan uang logam agar warna hijau daun bayam menempel
pada garis batas bawah kertas. Cara ini cukup sederhana sehingga tidak perlu
lagi dilakukan maserasi terhadap daun bayam.
Kromatografi
kertas dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan pigmen warna pada daun bayam.
Kromatografi kertas dapat digunakan untuk memisahkan pigmen warna, karena kertas
whatman yang digunakan sebagai fase diam mengandung serat selulosa yang dapat
menyerap pigmen-pigmen warna dari
campuran dalam daun bayam dengan gaya kapilaritas. Pigmen-pigmen warna akan berpindah tempat sepanjang
kertas dengan kecepatan yang berbeda sesuai dengan tingkat kepolaran
senyawa/pigmen dan pelarut yang digunakan, untuk membentuk sederet noda-noda yang terpisah. Kertas kromatografi tersebut digulung
dengan posisi garis hijau di luar agar pengamat dapat melihat proses elusi
dengan mudah. Untuk melakukan elusi, pemilihan pelarut harus diperhatikan agar
proses elusi berjalan dengan baik dan sebagian besar senyawa dapat terelusi.
Pada percobaan kromatografi kali ini, digunakan pelarut etanol karena pelarut
etanol dapat mengelusi senyawa yang polar maupun yang tidak polar. Kemampuan
ini dikarenakan etanol memiliki struktur C2H5OH yang
terdiri dari rantai hidrokarbon C2H5- yang
menyebabkan etanol dapat menarik senyawa nonpolar sedangkan adanya gugus -OH
yang bersifat polar dapat menarik senyawa polar. Dengan kemampuan ini
diharapkan etanol dapat mengelusi semua senyawa yang ada di dalam daun bayam.
Namun, sebelum kertas saring dimasukkan ke dalam gelas beaker yang berisi
etanol, sebaiknya gelas beaker berisi etanol itu dijenuhkan terlebih dahulu.
Penjenuhan ini bertujuan untuk menyeimbangkan tekanan atmosfer di dalam dan di
luar chamber agar noda berjalan lurus (tidak berkelok-kelok). Tekanan atmosfer
di luar dan di dalam chamber dikatakan seimbang apabila perembesan pelarut ke
kertas saring sudah mencapai ke luar chamber. Maka dari itu untuk melihat
kejenuhan chamber, kertas saring harus mencapai luar chamber sehingga dapat
menghubungkan antara luar dan dalam chamber.
Hal penting yang perlu diperhatikan dalam memasukkan
kertas saring dalam beaker glass
adalah pelarut harus berada di bawah garis batas bawah, agar pelarut tidak
mencapai garis hijau. Pelarut tidak boleh mencapai garis hijau untuk
menghindari senyawa yang terdapat pada garis hijau melarut dalam pelarut. Pada
saat elusi berlangsung, beaker glass
harus dalam keadaan tertutup supaya kejenuhan beaker glass tidak terganggu sehingga tidak berdampak pada proses elusi, yang dapat berakibat pada
pembelokan noda dan akhirnya perhitungan Rf masing-masing noda menjadi kurang
tepat. Elusi dapat terjadi karena pengaruh dari dorongan pelarut pengembang
(etanol) dan gaya kapilaritas. Kertas kromatografi dikeringkan untuk menguapkan
pelarut etanol dan harus dikeringkan di tempat yang terlindung cahaya untuk
menghindari rusaknya senyawa pada kromatogram karena kemungkinan senyawa pada
kromatogram mudah teroksidasi jika terpapar cahaya.
Berdasarkan hasil pengamatan, terlihat adanya noda-noda
yang berwarna kuning, hijau, dan kuning muda kehijauan dari hasil proses elusi.
Warna-warna noda ini menunjukkan senyawa tertentu karena senyawa-senyawa
tertentu memiliki warna yang tertentu pula. Noda yang berwarna kuning
kemungkinan adalah senyawa karotenoid, warna hijau kemungkinan senyawa klorofil
a dan warna kuning muda kehijauan kemungkinan klorofil b. Dugaan ini
berdasarkan literatur bahwa karotenoid
berwarna kuning-merah, klorofil a berwarna hijau kebiruan, dan klorofil b
kuning kehijauan. Namun noda-noda ini belum pasti senyawa karotenoid, klorofil
a dan klorofil b, karena banyak senyawa yang memiliki warna yang sama. Untuk
mengetahui dengan pasti jenis noda-noda ini merupakan senyawa karotenoid,
klorofil a dan klorofil b maka harus dihitung harga Rf nya karena harga Rf
merupakan identitas dari suatu senyawa.
Berdasarkan hasil perhitungan, harga Rf dari noda
berwarna kuning (kemungkinan senyawa karotenoid), hijau (kemungkinan senyawa
klorofil a), dan kuning muda kehijauan (kemungkinan senyawa klorofil b)
masing-masing sebesar 0,4; 0,8; 0,93. Dari harga Rf ini menunjukkan noda-noda
tersebut bukan senyawa karotenoid, klorofil a, dan klorofil b karena
berdasarkan literatur harga Rf klorofil a, klorofil b dan karotenoid
masing-masing sebesar 0,4; 0,38;0,625 (Wiwing, 2005). Namun peneliti boleh saja
mengatakan noda-noda tersebut merupakan senyawa yang dimaksud mengingat
warna-warna dari noda dan karena seringkali nilai Rf berbeda dari satu kertas ke kertas
lainnya (Basset, 1994). Kemungkinan harga Rf dari literatur menggunakan kertas
yang berbeda dengan kertas yang digunakan saat peneliti praktikum sehingga
nilai Rf yang diperoleh juga berbeda. Maka dari itu, harus dilakukan pengujian panjang gelombang pada
masing-masing noda untuk memastikan senyawa tersebut merupakan klorofil a,
klorofil b dan karotenoid dengan menggunakan spektroskopi UV-Vis.
Sebelum dilakukan
pengujian, senyawa-senyawa pada noda yang masih menempel pada kertas kromatografi harus dilarutkan dalam pelarut
etanol agar dapat dilakukan pengujian, karena analisis spektroskopi harus
menggunakan sampel dalam bentuk cairan. Kromatogram memiliki senyawa-senyawa
yang berbeda dilihat dari warna nodanya. Maka masing-masing noda harus dipotong
untuk memisahkan senyawa-senyawa itu. Masing-masing potongan noda dilarutkan
kembali ke dalam 5 ml etanol. Etanol digunakan karena dengan alasan yang sama,
yaitu agar dapat melarutkan senyawa yang polar maupun nonpolar. Dan pelarut
etanol juga memenuhi syarat sebagai pelarut untuk analisis spektroskopi karena
etanol tidak berwarna. Karena apabila digunakan pelarut yang
memiliki warna, pelarut tersebut akan ikut mengabsorbsi λ pada daerah
pengukuran sehingga mempengaruhi panjang gelombang maksimum senyawa pada noda. Melarutnya senyawa pada potongan-potongan
noda dapat dilihat dari melunturnya warna noda pada potongan-potongan tersebut.
Apabila semua senyawa sudah melarut, maka larutan tersebut dimasukkan ke dalam
botol vial dan diberi label harga Rf nya masing-masing supaya masing-masing senyawa
tidak tertukar harga Rf nya saat dilakukan analisis.
Sebelum dilakukan pengujian,
pengoperasian alat spektroskopi UV-Vis, dipilih panjang gelombang 200-800 nm
karena panjang gelombang sinar UV berkisar dari 200-350 nm dan panjang
gelombang sinar tampak berkisar dari 350-800 nm, dengan penggunaan panjang
gelombang 200-800 nm maka diharapkan panjang gelombang maksimum sampel dapat
teramati. Pada pemasangan
kuvet pada alat instrumentasi, kuvet ini harus dipasang tegak lurus terhadap
arah sinar, tujuannya untuk meminimalkan pengaruh pantulan radiasi. Dalam
penggunaan kuvet juga harus diperhatikan, yaitu kuvet ini harus dipegang pada
bagian buram supaya tidak ada noda yang berasal dari jari menempel pada bagian
bening kuvet tersebut, tujuannya supaya dapat mentransmisikan semua cahaya yang
melewati kuvet. Pelarut
etanol yang digunakan tersebut dijadikan
sebagai blanko dengan tujuan untuk mengkalibrasi alat instrumentasi
spektroskopi UV-Vis agar dapat meminimalisir kesalahan pada pemakaian
instrumentasi spektroskopi UV-Vis sehingga diperoleh besar absorbansi dan
panjang gelombang maksimum sampel dengan teliti.
Setelah alat
spektroskopi UV-Vis dikalibrasi, larutan sampel dimasukkan ke dalam alat
instrument spektroskopi UV-Vis untuk mengukur absorbansi sampel sehingga
diketahui panjang gelombang maksimum
masing-masing senyawa pada noda. Setelah sampel dimasukkan ke
dalam kuvet, cahaya monokromatik yang melewati sampel akan diserap sehingga
menyebabkan elektron
pada sampel mengalami transisi
dari tingkat energi
dasar ke tingkat energy yang lebih tinggi. Kemudian, elektron tersebut mengalami perpindahan
kembali dari tingkat energy yang lebih tinggi ke tingkat energi yang lebih rendah (mengalami relaksasi) dengan memancarkan cahaya dengan
panjang gelombang tertentu. Cahaya yang dipancarkan ini akan diteruskan ke detektor untuk diubah menjadi signal listrik.
Dan sinyal
listrik akan diterima oleh amplifier.
Amplifier ini berfungsi untuk
memperkuat hasil pembacaan detector dalam hal panjang gelombang. Selanjutnya
panjang gelombang tersebut dilanjutkan ke rekorder untuk mengubah ke dalam
bentuk sinyal-sinyal listrik dalam bentuk spektrum. Jadi fungsi rekorder disini yaitu
mengubah panjang gelombang hasil deteksi dari detector yang diperkuat oleh amplifier menjadi sinyal-sinyal listrik
dalam bentuk spectrum. Sinyal-sinyal listrik dalam bentuk spectrum ini
dilanjutkan ke tahap berikutnya yaitu dibawa ke monitor sehingga dapat dibaca
dan dapat di print.
Pada golongan
karotenoid, klorofil a dan klorofil b, transisi yang relevan terjadi dengan
transisi ___*, di mana salah satu elektron ikatan dari terkonjugasi tereksitasi
dari orbital _ ke orbital antibondingnya _*. Pada senyawa karotenoid, klorofil
a dan klorofil b, elektron _ terdelokalisasi sangat besar mengingat sangat panjangnya
sistem konjugasi ikatan ganda yang dimiliki. Hal ini mengakibatkan proses
eksitasi terjadi dengan energi yang relatif rendah, yang umumnya senyawa karotenoid,
klorofil a dan klorofil b menjadi berwarna karena energi eksitasinya yang
rendah (Britton et al, 1995). Berdasarkan hasil spektroskopi UV-Vis,
diperoleh absorbansi maksimum dari noda kuning dengan Rf 0,4 adalah 1,411;
absorbansi maksimum dari noda hijau dengan Rf 0,8 adalah 1,169; dan absorbansi
maksimum dari noda kuning muda kehijauan dengan Rf 0,93 adalah 0,829, sehingga
panjang gelombang maksimum masing-masing noda adalah 220 nm, 208,1 nm, dan
207,0 nm. Dari panjang maksimum yang diperoleh, maka noda-noda tersebut bukan
klorofil a, klorofil b dan karotenoid karena berdasarkan literatur panjang
gelombang maksimum klorofil a adalah 430 nm dan 669 nm, panjang gelombang
klorofil b adalah 453 nm dan 652 nm, sedangkan panjang gelombang maksimum karotenoid
adalah 430-480 nm. Perbedaan panjang gelombang maksimum yang diperoleh dari
percobaan dengan literatur kemungkinan dikarenakan pada saat pengujian dengan
spektroskopi UV-Vis, larutan sampel tidak mencapai 2/3 kuvet karena sampel
sudah menguap. Sehingga cahaya monokromatis alat spektroskopi UV-Vis hanya
mengenai sedikit larutan sampel dan larutan sampel hanya menyerap sedikit
cahaya monokromatis yang menyebabkan panjang gelombang maksimumnya lebih kecil
dari panjang gelombang maksimum literatur. Oleh karena kesalahan-kesalahan yang
dapat terjadi saat praktikum, maka noda dari daun bayam dapat dikatakan
mengandung senyawa klorofil a, klorofil b dan karotenoid. Dan dari literatur
dikatakan bahwa bayam mengandung beta karotenoid, maka golongan karotenoid pada
bayam yang berwarna kuning tersebut adalah beta karotenoid.
Berdasarkan
data-data spektrum yang ditunjukkan oleh instrumentasi spektroskopi UV-Vis maka
struktur dari klorofil a, klorofil b, dan beta karotenoid adalah sebagai
berikut:
Beta karotenoid
H. KESIMPULAN
Kesimpulan
dari percobaan ini adalah:
1.
Panjang
gelombang maksimum noda berwarna kuning adalah 220 nm, panjang gelombang
maksimum noda berwarna hijau adalah 208,1 nm, panjang gelombang maksimum noda
berwarna kuning muda kehijaun adalah 207,0 nm
2.
Harga
Rf noda berwarna kuning, hijau, dan kuning muda kehijauan masing-masing sebesar
0,4;0,8 dan 0,93
3.
Daun
bayam mengandung beta karotenoid, klorofil a dan klorofil b.
I. DAFTAR PUSTAKA
Basset, J, et al. 1994. Buku
Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Penerbit buku kedokteran EGC. Jakarta.
Britton, G, Jensen, S.L., and Pfander, H., 1995, Carotenoids
Volume IA: Isolation and Analysis, Birkhauser Verlag, Berlin p. 211.
Krisnandi
IH. 2002. Pengantar Analisis Instrumental.
Bogor: Sekolah Menengah Analisis Kimia Bogor.
Sastroamidjojo
H. 1991. Spektroskopi. Yogyakarta:
Liberty.
Scwartz, S.J. dan J.H.V. Elbe. 1996. Colorants. Di dalam Food Chemistry. Third
Edition. O.R. Fennema (ed). Marcel Dekker Inc. New York.
Sitorus
M. 2009.Spektroskopi Eludasi Struktur
Molekul Organik.Yogyakarta:Graha Ilmu.
